IPL с технологией AOPT-LTL эффективен в лечении мелазмы

Авторы статьи:

Jing Wang^{1, 2} | Xinlan Wang^{1, 2} | Li Gu1 | Zhinan Shi³ | Zhiyi Xu^{1, 2} | Siqi Shen^{1, 2} | Liqun Gu¹ | Lin Chen⁴ | Linling Ju⁴ | Chenglong Jin⁵ | Bingrong Zhou⁶ | Hui Hua¹

Содержание

• 1. Введение
• 2. Методы
• 3. Результаты
• 4. Обсуждение
• 5. Вывод

Статья получена: 4 марта 2025 года, изменена: 30 июля 2025 года, принята к публикации: 1 сентября 2025 года

Финансирование: исследование проводилось при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (National Natural Science Foundation of China) (82073472), Программы развития научных исследований и практических инноваций для аспирантов провинции Jiangsu (Postgraduate Research & Practice Innovation Program of Jiangsu Province) (SJCX23_1804), Специального исследовательского фонда Университета г. Нантунь (University Special Research Fund for Clinical Medicine) (грант 2024JZ021, 2024LQ041) и Программы по привлечению молодых талантов в области медицины города Нантунь (Nantong Young Medical Key Talent Program).

РЕЗЮМЕ

Цель. Оценка эффективности и механизма действия продвинутой технологии оптимального импульса (AOPT) с низкими параметрами энергии и тройным импульсом большой ширины (AOPT-LTL) при лечении мелазмы.

Методы. In vivo модель мелазмы у морских свинок создавали за счет инъекций прогестерона и облучения ультрафиолетом типа В. Три сеанса терапии методом AOPT-LTL проводили один раз в неделю. Уровни экспрессии мРНК основных ферментов, участвующих в меланогенезе, воспалительных факторов, цитокинов, участвующих в ангиогенезе, и коллагенолитических протеаз выявляли методом количественного ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Уровень белка фактора роста стволовых клеток (SCF) и гена рецептора фактора роста тучных клеток (c-KIT) выявляли за счет иммунофлуоресцентного окрашивания и анализа методом Вестерн-блоттинг. Двадцати пациентам, страдающим мелазмой, проводили три сеанса AOPT-LTL-терапии, по одному в месяц, после чего подсчитывали Модифицированный индекс площади и тяжести мелазмы (mMASI) и Индекс эритемы (EI).

Результаты. У морских свинок с мелазмой процедуры AOPT-LTL эффективно уменьшали пигментацию и подавляли экспрессию основных генов, вовлеченных в процесс выработки меланина. При этом наблюдалось уменьшение инфильтрации тучных клеток, экспрессии факторов воспаления и факторов, участвующих в ангиогенезе, а также уменьшение ангиогенеза и замедление фотостарения кожи. Кроме того, процедуры AOPT-LTL уменьшали уровень экспрессии сигнального пути SCF/c-KIT лиганд/рецептор, который тесно ассоциирован с пролиферацией и активацией тучных клеток. После трех сеансов AOPT-LTL-терапии у пациентов, страдающих мелазмой, наблюдалось уменьшение содержания меланина, выраженности эритемы, а также снижение индексов mMASI и EI.

Выводы: процедуры AOPT-LTL существенно улучшают состояние мелазмы за счет снижения интенсивности меланогенеза, уменьшения воспаления, ангиогенеза, инфильтрации тучных клеток и дегенерации коллагена, потенциально, за счет подавления экспрессии сигнального пути SCF/c-KIT лиганд/рецептор.

1. Введение

Мелазма – это приобретенная пигментация на лице, характеризующаяся крупными, симметрично расположенными на скуловой части щек, в периорбитальной зоне, на лбу, над верхней губой, на носу и других участках лица пятнами от светло-коричневого до темно-коричного цвета, имеющими форму бабочки или неправильную форму. Частота появления мелазмы зависит от расовой и гендерной принадлежности, и особенно часто встречается у представителей темнокожих рас (40 %).

Мелазма преимущественно встречается у женщин, особенно репродуктивного возраста [1], а также у молодых пациентов и лиц среднего возраста. Из-за повышенной чувствительности к ультрафиолету светлая кожа также подвержена мелазме [2]. Выражающаяся в появлении пигментации на лице, мелазма часто приводит к заниженной самооценке, создает проблемы в социальной адаптации, приносит негативные эмоции и снижает качество жизни [3], что требует разработки эффективных мер по ее предупреждению и лечению.

Патогенез заболевания сложен и ассоциируется с генетической предрасположенностью, колебаниями уровня эстрогена, длительным воздействием ультрафиолета [4–6]. Гистопатологически мелазма характеризуется гиперпигментацией на уровне дермы, гиперфункцией меланоцитов, излишней активностью меланосом, гиперваскуляризацией дермы, инфильтрацией тучных клеток и дегенерацией эластина [7–9].

Воздействие ультрафиолета стимулирует тучные клетки к формированию пигментации на лице за счет выброса гистамина и цитокинов в дерме, а также усилению пролиферации и миграции меланоцитов [10]. Кроме того, тучные клетки стимулируют пролиферацию сосудов за счет секреции проангиогенных факторов, таких как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста фибробластов (FGF-2) и трансформирующий фактор роста бета (TGF-β) [11].

Предыдущие исследования подтвердили влияние тучных клеток на фотостарение кожи. Трипсин, вырабатываемый тучными клетками под длительным воздействием ультрафиолетового излучения, напрямую вызывает дегенерацию эластина и опосредованно стимулирует деградацию дермального коллагена и внеклеточного матрикса через активацию проматричной металлопротеиназы [12]. Способы лечения активной мелазмы и мелазмы в стадии ремиссии различаются.

Системное применение транексамовой кислоты, глицирризина и глутатиона, дополняемое поверхностным нанесением гидрохинона и его производных, третиноина, азелаиновой и транексамовой кислот являются предпочтительными в активной стадии заболевания. В ремиссии дополнительно можно проводить химический пилинг и фотоэлектротерапию. Тем не менее длительное системное и поверхностное лечение приводят к побочным эффектам, таким как нарушение коагуляции, дисфункция ЖКТ и местное раздражение [13].

Метод воздействия интенсивным импульсным светом (IPL), основанный на энергии некогерентного широкополосного света в диапазоне длин волн от 400 до 1200 нм, применяется для фототерапии пигментации, лечения сосудистых заболеваний, удаления волос и омоложения кожи [14].

IPL показал эффективность в отношении мелазмы [15, 16], хотя клиническое его применение скомпрометировано случаями повторной пигментации из-за выбора агрессивных параметров воздействия [17]. Фотобиомодуляция, основанная на применении лазерного излучения или некогерентного света, может влиять на физиологические функции. Метод характеризуется неинвазивностью, низкими параметрами энергии и нетермическим эффектом.

Dai и соавт. [18] сообщали о роли фотобиомодуляции с использованием светодиодных (LED) устройств с длиной волны 590 нм для уменьшения пигментации и эритемы у пациентов, страдающих мелазмой. Наше предыдущее исследование подтвердило превосходную терапевтическую эффективность IPL в сочетании с фотобиомодуляцией при работе в инновационном режиме с использованием продвинутой технологии оптимального импульса с низкой энергией, тройным импульсом, большой продолжительностью импульса (AOPT-LTL) при лечении розацеа [19]. Тем не менее неясно, эффективен ли этот режим в отношении мелазмы и механизм его действия на нее.

В данном исследовании мы сначала изучали эффективность AOPT-LTL в лечении мелазмы и механизм его действия на модели морских свинок, а затем подтверждали ее на примере когорты из 20 пациентов, страдающих мелазмой.

2. Методы

2.1. In vivo модель мелазмы у морской свинки и процедуры AOPT-LTL

Двадцать особей трехцветной морской свинки женского пола в возрасте 6–8 недель, весом 250 ± 15 граммов помещали в стерильные боксы, оборудованные мягкой подстилкой, обеспечивая стандартизированные условия (температура 22 °C ± 2 °C, 12-часовой цикл света/темноты) пребывания, где оставляли на одну неделю. До лечения шерсть на спинках свинок каждые три дня сбривали (участок 5 х 5 см).

Морских свинок случайным образом распределяли на две группы – исследуемую и контрольную, по 10 особей в каждой. Спинки каждой свинки в группах также разделяли на подгруппы: контрольная, контрольная + AOPT-LTL, исследуемая «мелазма», исследуемая «мелазма + AOPT-LTL» соответственно.

Морским свинкам из исследуемой группы с мелазмой и «Мелазма + AOPT-LTL» каждое утро проводили инъекции прогестерона 7,5 мг/кг (Jilin Huamu Animal Health Products Co. Ltd) в заднюю лапку (лапы чередовали во избежание многократных инъекций).

Широкое изучение подтвердило, что только лишь воздействие ультрафиолета типа В (UVB) может успешно формировать мелазму у животных и что UVB напрямую активирует меланоциты, одновременно стимулируя кератиноциты к высвобождению промеланогенных факторов. Поэтому для моделирования мелазмы мы применяли UVB.

Морских свинок подвергали воздействию дозой UVB, составлявшей 500 мДж/см², на протяжении одного часа ежедневно в самодельном боксе для облучения, глаза животных были защищены, расстояние до ламп, излучающих ультрафиолет типа В (JCB35-24-01, Sigma, Shanghai, China), составляло 50 см. Интенсивность излучения UVB измеряли при помощи УФ-радиометра (Sigma, Shanghai, China), за изменениями на коже свинок наблюдали ежедневно на протяжении 30 дней.

После моделирования мелазмы начинали AOPT-LTL-терапию, проводя по три сеанса с недельным интервалом. Перед процедурой на спинки морских свинок наносили прозрачный бесцветный гель, затем проводили воздействие с использованием платформы M22 (Lumenis Medical Company, USA) (фильтр 590 нм, плотность энергии 10 Дж/см², три импульса, ширина импульса 8-6-6 мс, интервал между импульсами 40 мс).

Во избежание чрезмерной стимуляции кожи животных, обеспечения стабильности режима и использования стандартизированных параметров для валидации механизма действия, флюенс фиксировали на значении 10 Дж/см². Изображения кожи спинок создавали с использованием цифровой камеры (EOS 90D, Canon, Japan). Образцы кожи брали через неделю после окончания эксперимента.

2.2. Пациенты с мелазмой и процедуры AOPT-LTL

Два дерматолога независимо друг от друга вовлекли в исследование двадцать пациентов с клинически диагностированной мелазмой. Из исследования были исключены пациенты с воспалительными заболеваниями кожи лица (например, розацеа, поствоспалительная гиперпигментация), рубцами, иными расстройствами, связанными с гиперпигментацией, пациенты, прошедшие фотоэлектротерапию или медикаментозное лечение менее чем за 3 месяца до исследования, беременные и кормящие женщины.

Всем пациентам провели по три сеанса фототерапии с использованием платформы для лазерного ремоделирования кожи М22 (Lumenis, Israel), светофильтров 590/640 нм (плотность энергии 10–16 Дж/см², тройной импульс, ширина импульса 8-6-6 мс, интервал между импульсами 35–40 мс). В отличие от эксперимента на животных, процедуры в отношении людей должны учитывать индивидуальную переносимость пациента. Значение флюенса в диапазоне 10–16 Дж/см² выбирали исходя из фототипа пациента по Фицпатрику, глубины залегания пигмента, реакции сосудов и с учетом нагрева кожи до температуры не выше 38,5 °C (во избежание повреждения) при фотобиомодуляции.

До и через 1 месяц после каждого сеанса создавали снимки кожи лица, которые анализировали при помощи мультиспектральной станции обработки изображений (Jiangsu Beining Intelligent Technology Development Co. Ltd., China). Выраженность мелазмы независимо друг от друга оценивали два дерматолога, используя системы оценки – модифицированный индекс площади и тяжести мелазмы (mMASI) и индекс эритемы (EI).

2.3. Окрашивание гистологических образцов

Образцы кожи морских свинок фиксировали в 4% параформальдегиде на протяжении не менее 24 часов, заливали в парафин и разрезали на секции толщиной 3–5 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином (H&E), методами трихромного окрашивания по Массону, Фонтана-Массона и толуидиновым синим. Затем проводили анализ шести случайным образом отобранных образцов.

В частности, распределение меланина в коже визуализировали с помощью окрашивания гематоксилином и эозином, а также методом Фонтана-Массона; волокна коллагена, распределённые в дерме, оценивали методом трихромного окрашивания по Массону; инфильтрацию тучных клеток анализировали с использованием окрашивания толуидиновым синим. Для количественного анализа патологических изменений применяли программу Image-Pro Plus (Media Cybernetics Inc).

2.4. Иммуногистохимическое и иммунофлуоресцентное окрашивание

Для депарафинизации и восстановления антигена срезы обрабатывали в натрий-цитратном буфере (pH 6,0) или буферном растворе на основе этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA, pH 9,0), для блокировки активности пероксидазных ферментов — в 3% перекиси водорода и инкубировали с красящими реагентами (все от Servicebio, Wuhan, China) в 3% растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA).

После иммуногистохимического окрашивания срезы инкубировали с первичными антителами кролика к CD31 (1 : 100, Venus Gene, China) при температуре 4 °C в течение ночи, трижды промывали в фосфатно-солевом буферном растворе с Tween-20 (PBST) по 5 минут и инкубировали со вторичными антителами козы к иммуноглобулинам кролика (1 : 300, Servicebio, China) в течение одного часа при комнатной температуре. После повторной промывки срезы окрашивали 3,3′-диаминобензидином (DAB), подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином, обезвоживали и запечатывали для микроскопического наблюдения.

Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили путём инкубации срезов с первичными антителами кролика: anti-c-KIT (1 : 500, Abcam, ab283653, UK) и anti-SCF (1 : 500, Abcam, ab64677, UK), оставляя при 4 °C на ночь, после чего трижды промывали в промывочном растворе по 5 минут. Затем срезы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре со вторичными антителами козы к иммуноглобулинам кролика, конъюгированными с флуоресцентными красителями Cy3 и FITC (1 : 300, Servicebio, China).

После промывки срезы инкубировали с DAPI в темноте в течение 10 минут, запечатывали и наблюдали под флуоресцентным микроскопом. Статистический анализ интенсивности флуоресценции проводили с использованием программы Image-Pro Plus.

Рисунок 1. (Кликните на фото, чтобы его увеличить)
Процедуры AOPT-LTL уменьшают пигментацию у морских свинок с мелазмой. (A) Изображение пигментации кожи морских свинок крупным планом и количественное выражение значений серого (1. Контрольная группа до моделирования; 2. Контрольная группа; 3. Контрольная + AOPT-LTL группа; 4. Исследуемая группа с мелазмой до моделирования; 5. Исследуемая группа с мелазмой в конце моделирования; 6. Исследуемая группа с мелазмой; 7. Исследуемая группа «Мелазма + AOPT-LTL»). (B–D) Окрашивание кожи H&E (B) и окрашивание методом Фонтана-Массона (C, D) (увеличение = 20х, масштабная шкала = 200 мкм). (E) Уровни мРНК TYR, TRP-1, TRP-2 и MITF в коже. n = 5, #p < 0,05 vs. Контрольная группа, *p < 0,05 vs. Контрольная + AOPT-LTL группа

2.5. Количественный анализ методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (qRT-PCR, ОТ-ПЦР)

РНК из образцов кожи выделяли при помощи 1 мл реагента TRIzol (Takara, Shiga, Japan). Общую РНК экстрагировали с использованием устройства для высокоскоростного криогенного измельчения тканей (Servicebio, China) и проводили обратную транскрипцию в кДНК с использованием 2000 нг РНК и набора PrimeScript RT (Takara, Shiga, Japan). Анализ qRT-PCR выполняли с применением реагента TB Green Premix Ex Taq II (Takara, Shiga, Japan) и системы BIO-RAD CFX (Bio-Rad, Munich, Germany). Для каждого образца исследование проводили в пяти повторах. Относительную экспрессию генов рассчитывали по методу 2−ΔΔCt, используя ген ACTB в качестве референсного. Праймеры были разработаны компанией Shanghai Sangon Bioengineering Co. Ltd., а их последовательности приведены в дополнительных материалах.

2.6. Вестерн-блоттинг

Лизис образцов кожи проводили в смеси буфера RIPA и ингибитора PMSF (Beyotime Biotechnology, China) в соотношении 100 : 1. Концентрацию общего белка определяли с помощью набора BCA Protein Assay Kit (Beyotime Biotechnology, China). Белки разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), после чего переносили на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) и блокировали в буферном растворе TBST, содержащем 0,05% Tween 20 и 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Первичные антитела — к c-KIT (1 : 5000, Abcam, ab283653, UK), к фактору стволовых клеток (SCF) (1 : 1000, Abcam, ab64677, UK) и к бета-актину (1 : 1000, Abcam, UK) — инкубировали в течение ночи при 4 °C, затем мембраны трижды промывали в TBST по 10 минут.

Далее мембраны инкубировали со вторичными антителами: козьими к иммуноглобулинам кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) (1 : 1000, Beyotime Biotechnology, China), или козьими к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с HRP (1 : 1000, Beyotime Biotechnology, China) — в течение 1 часа при комнатной температуре. Визуализацию белковых полос осуществляли с помощью системы Tanon 5200 Multi (Shanghai, China), а количественный анализ с нормализацией по бета-актину проводили в программе Image-Pro Plus.

2.7. Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием программы GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Сравнение групп проводили с применением t-критерия Стьюдента или однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Все данные, соответствующие нормальному распределению, представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Значение p < 0,05 считалось статистически значимым.

3. Результаты

3.1. Процедуры AOPT-LTL уменьшали пигментацию на коже морских свинок с мелазмой

Кожа морских свинок на участках, подвергавшихся воздействию ультрафиолета типа В (UVB), приобретала более тёмный цвет, демонстрировала повышенную концентрацию меланина, а значения серого уровня не снижались в течение одного месяца моделирования мелазмы, что подтверждало стабильность модели. После трёх сеансов AOPT-LTL наблюдалось значимое уменьшение пигментации кожи и снижение значений серого уровня (p < 0,05) (Рисунок 1A).

По сравнению с контрольной группой, в исследуемой группе «Мелазма» выявлялись выраженная эпидермальная гиперплазия и массивное отложение меланина в базальном слое (Рисунки 1B–D). Примечательно, что отложение меланина было существенно ниже в группе «Мелазма + AOPT-LTL» по сравнению с группой «Мелазма» (p < 0,05).

Кроме того, анализ qRT-PCR показал значительно более высокие уровни мРНК тирозиназы (TYR), тирозиназа-связанного белка 1 (TRP-1), тирозиназа-связанного белка 2 (TRP-2) и фактора транскрипции, ассоциированного с микрофтальмией (MITF) в группе «Мелазма» по сравнению с контрольной группой (p < 0,05) (Рисунок 1E); эти уровни достоверно снижались после проведения процедур AOPT-LTL.

3.2. Процедуры AOPT-LTL снижали воспалительную инфильтрацию при мелазме у морских свинок

Инфильтрацию тучных клеток наблюдали спорадически в контрольной группе, однако она была значительно выражена в группе «Мелазма». Напротив, количество тучных клеток в группе «Мелазма + AOPT-LTL» было существенно ниже, чем в группе «Мелазма» (p < 0,05) (Рисунки 2A, B). Уровни мРНК провоспалительных цитокинов — фактора некроза опухоли α (TNF-α), интерлейкина-1β (IL-1β) и интерлейкина-6 (IL-6), а также ключевых ферментов, регулирующих воспаление — индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS) и циклооксигеназы-2 (COX-2) — были значительно ниже в группе «Мелазма + AOPT-LTL» по сравнению с группой «Мелазма» (p < 0,05) (Рисунок 2C). За исключением COX-2, уровни мРНК остальных воспалительных маркеров не различались между контрольной группой и контрольной группой + AOPT-LTL (p > 0,05).

Рисунок 2. (Кликните на фото, чтобы его увеличить)
Процедуры AOPT-LTL уменьшают инфильтрацию тучных клеток у морских свинок с мелазмой. (A, B) Окрашивание толуидиновым синим инфильтрации тучных клеток в кожу (A) и количественное выражение (B) (увеличение = 20х, масштабная шкала = 200 мкм). (C) Уровни мРНК COX-2, INOS, TNF-α, IL-1β, и IL-6 в коже. n = 5, #p < 0,05 vs. Контрольная группа, *p < 0,05 vs. Контрольная + AOPT-LTL группа

3.3. Процедуры AOPT-LTL уменьшали ангиогенез в коже морских свинок с мелазмой

CD31 является установленным маркером ангиогенеза. Иммуногистохимическое окрашивание выявило выраженную васкуляризацию и значительно повышенную экспрессию CD31 в группе «Мелазма» по сравнению с контрольной группой (Рисунки 3A, B). Процедуры AOPT-LTL достоверно снижали плотность микрососудов. Гистамин, высвобождаемый тучными клетками, обладает вазодилатирующим действием. VEGF, TGF-β и FGF-2 — цитокины, стимулирующие пролиферацию эндотелиальных клеток. Уровни их мРНК были значительно выше в группе «Мелазма», чем в контрольной, но достоверно снижались под действием AOPT-LTL (p < 0,05) (Рисунок 3C).

Рисунок 3. (Кликните на фото, чтобы его увеличить)
Процедуры AOPT-LTL уменьшают ангиогенез у морских свинок с мелазмой. (A, B) Иммуногистохимическое окрашивание CD31 в коже (A) и количественное выражение (B) (увеличение = 20х, масштабная шкала = 200 мкм). (C) Уровни мРНК VEGF, TGF-β и FGF-2 в коже. n = 5, #p < 0,05 vs. Контрольная группа, *p < 0,05 vs. Контрольная + AOPT-LTL группа

3.4. Процедуры AOPT-LTL уменьшали признаки фотостарения кожи у морских свинок с мелазмой

По сравнению с контрольной группой, в исследуемых группах с мелазмой наблюдалось снижение содержания коллагеновых волокон, сопровождавшееся их выраженным беспорядочным расположением (p < 0,05) (Рисунки 4A, B). После проведения процедур AOPT-LTL количество коллагеновых волокон в дерме увеличивалось, а их организация становилась более упорядоченной и компактной (p < 0,05). Повышенные уровни мРНК двух ферментов, ответственных за деградацию коллагена — триптазы и матриксной металлопротеиназы-9 (MMP-9) — выявленные в группе с мелазмой, достоверно снижались на фоне AOPT-LTL-терапии (Рисунок 4C).

3.5. Процедуры AOPT-LTL, вероятно, снижали инфильтрацию тучных клеток у морских свинок с мелазмой за счёт подавления экспрессии сигнального пути SCF/c-KIT (лиганд/рецептор)

По сравнению с контрольной группой, в группе «Мелазма» в дерме наблюдалась выраженная коэкспрессия c-KIT (маркированного зелёным флуоресцентным красителем) и SCF (маркированного красным флуоресцентным красителем). Оба белка локализовались преимущественно в цитоплазме.

После процедур AOPT-LTL положительная иммунофлуоресцентная экспрессия c-KIT и SCF значительно снижалась (p < 0,05) (Рисунки 5A, D). Анализ методом вестерн-блоттинга подтвердил повышенную экспрессию белков c-KIT и SCF в дерме группы «Мелазма» по сравнению с контролем. Уровни этих белков достоверно уменьшались после AOPT-LTL-терапии (p < 0,05) (Рисунки 5B, C).

3.6. Процедуры AOPT-LTL облегчали клинические проявления мелазмы у пациентов

Изображения кожи пациентов с мелазмой получали до начала терапии (исходные данные) и через 1 месяц после каждого сеанса (Рисунок 6A). Процедуры AOPT-LTL приводили к значительному снижению содержания меланина и выраженности эритемы. Среднее значение модифицированного индекса площади и тяжести мелазмы (mMASI) достоверно уменьшилось с исходного 3,20 до 1,13 через месяц после трёх процедур IPL-терапии (p < 0,05) (Рисунок 6B). Индекс эритемы (EI) также существенно снизился — с 510 до 358 условных единиц (p < 0,05) (Рисунок 6C). Ни у одного из пациентов не было зарегистрировано серьёзных побочных эффектов, что подтверждает высокую безопасность AOPT-LTL-процедур.

Рисунок 4. (Кликните на фото, чтобы его увеличить)
Процедуры AOPT-LTL уменьшали признаки фотостарения и морских свинок с мелазмой. (A, B) Трихромное окрашивание коллагеновых волокон в коже по Массону и количественное выражение (увеличение = 20х, масштабная шкала = 200 мкм). (C) Уровни мРНК триптазы и MMP-9 в коже. n = 5, # p < 0,05 vs. Контрольная группа, *p < 0,05 vs. Контрольная + AOPT-LTL группа

4. Обсуждение

Результаты нашего исследования показали, что процедуры AOPT-LTL значительно уменьшали пигментацию кожи и выраженность эритемы как у морских свинок, так и у когорты пациентов, страдающих мелазмой. Инновационный режим AOPT-LTL позволял эффективно достигать цели, заключавшейся в снижении инфильтрации тучных клеток, ангиогенеза и воспаления в коже морских свинок с мелазмой, что, вероятно, связано с подавлением сигнального пути SCF/c-KIT (лиганд/рецептор) (Рисунок 7).

После трёх сеансов AOPT-LTL проявления мелазмы значительно уменьшались без значимых побочных эффектов. Низкоэнергетический Q-switched Nd:YAG-лазер с большим размером пятна широко применяется для лечения мелазмы в Азии. Он эффективно снижает пигментацию за счёт воздействия на меланосомы через субклеточный селективный фототермический эффект [20]. Тем не менее, для мелазмы характерен высокий уровень рецидивов — до 58,8 % через год после лечения [21]. Частые процедуры с использованием Q-switched Nd:YAG также могут вызывать побочные эффекты, такие как мозаичная гипопигментация, обусловленная короткой длительностью импульса и высокой пиковой энергией [22, 23].

Интенсивный импульсный свет (IPL), превосходящий традиционные лазерные методики, обеспечивает больший контроль над параметрами — количеством импульсов, их шириной и интервалом между ними — и позволяет подавать более умеренную энергию, оказывая меньшее раздражающее действие на меланоциты [19]. Li и соавт. [24] сообщали, что IPL (светофильтр 560/590 нм, флюенс 13–17 Дж/см², двойной импульс) существенно снижал индекс mMASI у пациентов с мелазмой. Однако ретроспективный анализ показал, что использование традиционных, рекомендованных производителем параметров IPL может приводить к развитию мелазмоподобной гиперпигментации при лечении пигментных расстройств кожи [17].

Рисунок 5. (Кликните на фото, чтобы его увеличить)
Процедуры AOPT-LTL уменьшают инфильтрацию тучных клеток у морских свинок с мелазмой за счет подавления сигнального пути SCF/c-KIT лиганд/рецептор. (A) Иммунофлуоресцентное окрашивание c-KIT и SCF в коже (увеличение = 20х, масштабная шкала = 200 μm). (B) Уровни белка c-KIT и SCF в коже. (C, D) Уровни мРНК c-KIT (C) SCF (D) в коже. n = 5, #p < 0,05 vs. контрольная группа, *p < 0,05 vs. Контрольная + AOPT-LTL группа

Хотя традиционный режим с высокой энергией и коротким импульсом обеспечивает избирательное термическое разрушение меланосом, высокоинтенсивный нагрев часто вызывает неспецифическое термическое повреждение окружающих тканей [14]. Воспаление, спровоцированное таким раздражением, усугубляет пигментацию у пациентов с мелазмой [25]. Bae и соавт. [15] обнаружили, что низкоэнергетический IPL (10 или 13 Дж/см², двойной импульс) обладает большими преимуществами и меньшим числом побочных эффектов при лечении мелазмы у азиатской популяции.

Режим AOPT-LTL характеризуется низкими энергетическими параметрами и тройным импульсом большой длительности. Хотя прямых сравнительных исследований AOPT-LTL и традиционной IPL-терапии пока нет, наши предварительные данные указывают, что три сеанса AOPT-LTL эффективно предотвращают термическое повреждение окружающих тканей и снижают как содержание меланина, так и инфильтрацию тучных клеток.

Инфильтрация тучных клеток является патологическим признаком мелазмы [8]. Ультрафиолетовое излучение и психологический стресс — основные факторы, стимулирующие рекрутирование и дегрануляцию тучных клеток [26]. Активированные тучные клетки усиливают синтез меланина за счёт выделения протеаз, эйкозаноидов и провоспалительных цитокинов. Кроме того, они способствуют созреванию и доставке меланосом к кератиноцитам [27–29].

Транексамовая кислота, уменьшая количество тучных клеток, эффективно снижает проявления мелазмы [30]. Недавнее исследование показало, что IPL-процедуры ослабляют воспалительную реакцию за счёт подавления дегрануляции тучных клеток [31]. В нашем исследовании AOPT-LTL-терапия значительно снижала инфильтрацию тучных клеток, уровень провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1β, IL-6) и экспрессию ключевых ферментов, участвующих в синтезе медиаторов воспаления (iNOS, COX-2) у морских свинок с экспериментальной мелазмой.

Избыточная экспрессия фактора стволовых клеток (SCF) и его рецептора c-KIT играет критическую роль в патогенезе мелазмы [32]. Связывание SCF с рецептором c-KIT на поверхности тучных клеток вызывает их дегрануляцию и высвобождение медиаторов, ассоциированных с мелазмой [33]. Dai и соавт. [18] показали, что LED-воздействие с длиной волны 590 нм значительно снижает выработку меланина за счёт подавления экспрессии SCF. В нашем исследовании процедуры AOPT-LTL достоверно ингибировали сигнальный путь SCF/c-KIT в коже морских свинок с мелазмой.

Как количество, так и объём кровеносных сосудов в очагах мелазмы увеличены. Существует положительная корреляция между степенью пигментации и васкуляризацией [7, 34]. Пролиферация сосудов способствует притоку воспалительных клеток и цитокинов — в частности, VEGF, TGF-β и FGF-2 — в поражённые участки кожи, формируя порочный круг, поддерживающий ангиогенез при мелазме [35].

Рисунок 6. (Кликните на фото, чтобы его увеличить)
Процедуры AOPT-LTL уменьшают клинические проявления мелазмы у пациентов (A) Показательные изображения в поляризованном свете (слева), ультрафиолетовом (посередине), многозональные изображения (справа) мелазмы у пациентов до (исходные) и через 1 месяц после каждого сеанса IPL-терапии. (B, C) Значения индексов mMASI (B) и CEA (C) у пациентов с мелазмой до и через 1 месяц после каждого сеанса IPL-терапии. n = 20. *p < 0,05 vs. Исходные; ns, незначительное различие

Клинический случай из контролируемого split-face исследования показал, что васкуляризация при мелазме значительно уменьшалась после комбинированной терапии импульсным лазером и наружными средствами по сравнению с монотерапией топическими препаратами, причём рецидивов не наблюдалось в течение трёх лет [36]. Это указывает на то, что воздействие на сосудистую составляющую может играть ключевую роль в профилактике рецидивов.

LED-терапия подавляет миграцию и образование тубулярных структур эндотелиальными клетками, тем самым уменьшая эритему, ассоциированную с мелазмой [18]. Важно отметить, что для целенаправленной коагуляции сосудов требуются высокие энергетические параметры IPL. Исследования показывают, что коагуляция крови возможна только при температуре выше 70 °C и достаточном повреждении стенки сосуда [37]. Очевидно, что использованные нами параметры AOPT-LTL не достигают температур, необходимых для коагуляции. Тем не менее Jiang и соавт. [31] продемонстрировали, что у пациентов с розацеа фотобиомодуляция с помощью IPL приводит к значительному снижению эритемы по клинической шкале оценки (CEA).

В нашем исследовании AOPT-LTL также эффективно подавляла экспрессию проангиогенных цитокинов (VEGF, TGF-β, FGF-2) в модели мелазмы у морских свинок и значительно снижала индекс эритемы (EI) у пациентов. Этот эффект, вероятно, обусловлен способностью AOPT-LTL подавлять пролиферацию эндотелиальных клеток и одновременно уменьшать количество тучных клеток и их дегрануляцию, что снижает высвобождение гистамина и опосредованно способствует вазоконстрикции.

Мелазму можно рассматривать как расстройство, связанное с фотостарением кожи, при котором наблюдается выраженная деградация и потеря коллагена в поверхностной дерме [38]. Генетическое профилирование выявляет повышенную экспрессию генов, связанных с деградацией коллагена, и снижение экспрессии генов, участвующих в его синтезе [39]. Xiao и соавт. [40] показали, что гель PF-GL-TE замедляет старение кожи за счёт минимизации потери коллагена у крыс с мелазмой. Наши результаты демонстрируют, что AOPT-LTL значительно увеличивает количество коллагеновых волокон в дерме и восстанавливает их организацию за счёт снижения экспрессии триптазы и MMP-9, тем самым контролируя признаки фотостарения у морских свинок с мелазмой.

Утолщение эпидермиса, наблюдавшееся у животных в участках с мелазмой, противоречит истончению эпидермиса, описанному в клинических исследованиях у людей с мелазмой [41]. Это расхождение требует дальнейшего изучения. В нашем исследовании модель мелазмы создавалась путём комбинированного воздействия прогестерона и UVB-облучения [42, 43].

Известно, что хроническое UVB-воздействие вызывает эпидермальную гиперплазию как защитную реакцию, усиливающую барьерную функцию кожи за счёт пролиферации кератиноцитов [44]. В нашей модели острый пролиферативный ответ на УФ-излучение, вероятно, доминирует и приводит к утолщению эпидермиса. Напротив, мелазма у человека — это хроническое состояние, развивающееся под влиянием множества факторов (длительное УФ-воздействие, гормональный дисбаланс, генетическая предрасположенность, нарушение барьерной функции), что со временем приводит к атрофии эпидермиса [45].

Это различие указывает на то, что, хотя животная модель эффективно воспроизводит пигментацию и воспалительный ответ, она не в полной мере отражает долгосрочную структурную деградацию, характерную для человеческой мелазмы. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, приведёт ли длительное наблюдение за животными с мелазмой к постепенному истончению эпидермиса, приближая модель к клинической картине у человека.

Рисунок 7. (Кликните на фото, чтобы его увеличить)
Графическое резюме. Процедуры AOPT-LTL действуют на мелазму за счет уменьшения меланогенеза, воспаления, ангиогенеза, инфильтрации тучных клеток и дегенерации коллагена через подавление сигнального пути SCF/c-KIT лиганд/рецептор у морских свинок

Настоящее исследование имеет определённые ограничения.

Во-первых, хотя полученные данные позволяют предположить, что AOPT-LTL улучшает пигментацию и эритему за счёт снижения инфильтрации тучных клеток in vivo, для подтверждения специфического механизма действия и установления причинно-следственных связей необходимы дополнительные эксперименты in vitro.

Во-вторых, в отсутствие прямого сравнения AOPT-LTL и традиционной IPL-терапии требуются специализированные рандомизированные сравнительные исследования. Наконец, для оценки клинической эффективности AOPT-LTL, частоты рецидивов и долгосрочной безопасности необходимы более крупные когорты пациентов и длительный период наблюдения.

5. Вывод

Таким образом, три процедуры AOPT-LTL эффективны для лечения мелазмы за счёт снижения меланогенеза, инфильтрации тучных клеток, воспаления, ангиогенеза и деградации коллагена. Кроме того, они способствуют подавлению пролиферации и миграции тучных клеток, вероятно, посредством модуляции сигнального пути SCF/c-KIT (лиганд/рецептор).

Вклады авторов
Идея и дизайн экспериментов: Jing Wang, Xinlan Wang, Li Gu, Bingrong Zhou, Hui Hua. Проведение экспериментов и анализ данных: Jing Wang, Xinlan Wang, Li Gu. Предоставление реагентов/материалов/инструментов анализа: Zhinan Shi, Zhiyi Xu, Siqi Shen. Исследования: Liqun Gu, Chenglong Jin. Methodology: Lin Chen, Linling Ju. Проверка и редактирование: Bingrong Zhou, Hui Hua. Написание: Jing Wang, Xinlan Wang, Li Gu. Все авторы одобрили отправку данной версии рукописи.

Заявления о соблюдении этических норм
Исследование проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и одобрено Комитетом по этике Третьей народной больницы г. Нантуня (Nantong Third People’s Hospital) (номер одобрения: EL2024024).

Информированное согласие
Информированное согласие получено от всех пациентов, участвовавших в исследовании. Участники были набраны среди пациентов Третьей народной больницы г. Нантуня с клинически подтверждённой мелазмой. Исследования на животных одобрены Комитетом Нантуньского университета по этике при проведении исследований на животных (Animal Ethics Committee of Nantong University; номер одобрения: S20240215-031) и выполнены в соответствии с действующими этическими нормами. Морские свинки предоставлены Центром лабораторных животных Нантуньского университета (Laboratory Animal Center of Nantong University).

Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Заявление о доступности данных
Данные, подтверждающие результаты данного исследования, доступны в разделе «Дополнительная информация» к данной статье.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. N. Neagu, C. Conforti, M. Agozzino, et al., “Melasma Treatment: A Systematic Review,” Journal of Dermatological Treatment 33, no. 4 (2022): 1816–1837.
2. D. Hexsel, D. A. Lacerda, A. S. Cavalcante, et al., “Epidemiology of Melasma in Brazilian Patients: A Multicenter Study,” International Journal of Dermatology 53, no. 4 (2014): 440–444.
3. R. Yalamanchili, V. Shastry, and J. Betkerur, “Clinico-Epidemiological Study and Quality of Life Assessment in Melasma,” Indian Journal of Dermatology 60, no. 5 (2015): 519.
4. O. A. Ogbechie-Godec and N. Elbuluk, “Melasma: An up-To-Date Comprehensive Review,” Dermatology and Therapy 7, no. 3 (2017): 305–318.
5. E. Bostan and A. Cakir, “The Dermoscopic Characteristics of Melasma in Relation to Different Skin Phototypes, Distribution Patterns and Wood Lamp Findings: A Cross-Sectional Study of 236 Melasma Lesions,” Archives of Dermatological Research 315, no. 7 (2023): 1927–1938.
6. J. P. Ortonne, I. Arellano, M. Berneburg, et al., “A Global Survey of the Role of Ultraviolet Radiation and Hormonal Influences in the Development of Melasma,” Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 23, no. 11 (2009): 1254–1262.
7. E. H. Kim, Y. C. Kim, E. S. Lee, and H. Y. Kang, “The Vascular Characteristics of Melasma,” Journal of Dermatological Science 46, no. 2 (2007): 111–116.
8. R. Hernandez-Barrera, B. Torres-Alvarez, J. P. Castanedo-Cazares, C. Oros-Ovalle, and B. Moncada, “Solar Elastosis and Presence of Mast Cells as Key Features in the Pathogenesis of Melasma,” Clinical and Experimental Dermatology 33, no. 3 (2008): 305–308.
9. S. H. Kwon, Y. J. Hwang, S. K. Lee, and K. C. Park, “Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications,” International Journal of Molecular Sciences 17, no. 6 (2016): 824.
10. N. H. Kim and A. Y. Lee, “Histamine Effect on Melanocyte Proliferation and Vitiliginous Keratinocyte Survival,” Experimental Dermatology 19, no. 12 (2010): 1073–1079.
11. E. Crivellato, B. Nico, and D. Ribatti, “Mast Cells and Tumour Angiogenesis: New Insight From Experimental Carcinogenesis,” Cancer Letters 269, no. 1 (2008): 1–6.
12. I. Fajardo and G. Pejler, “Human Mast Cell Beta-Tryptase Is a Gelatinase,” Journal of Immunology 171, no. 3 (2003): 1493–1499.
13. H. Konisky, E. Balazic, J. A. Jaller, U. Khanna, and K. Kobets, “Tranexamic Acid in Melasma: A Focused Review on Drug Administration Routes,” Journal of Cosmetic Dermatology 22, no. 4 (2023): 1197–1206.
14. P. Babilas, S. Schreml, R. M. Szeimies, and M. Landthaler, “Intense Pulsed Light (IPL): A Review,” Lasers in Surgery and Medicine 42, no. 2 (2010): 93–104.
15. M. I. Bae, J. M. Park, K. H. Jeong, M. H. Lee, and M. K. Shin, “Effectiveness of Low-Fluence and Short-Pulse Intense Pulsed Light in the Treatment of Melasma: A Randomized Study,” Journal of Cosmetic and Laser Therapy 17, no. 6 (2015): 292–295.
16. L. Figueiredo Souza and S. Trancoso Souza, “Single-Session Intense Pulsed Light Combined With Stable Fixed-Dose Triple Combination Topical Therapy for the Treatment of Refractory Melasma,” Dermatologic Therapy 25, no. 5 (2012): 477–480.
17. L. Fang, M. H. Gold, and L. Huang, “Melasma-Like Hyperpigmentation Induced by Intense Pulsed Light Treatment in Chinese Individuals,” Journal of Cosmetic and Laser Therapy 16, no. 6 (2014): 296–302.
18. X. Dai, S. Jin, Y. Xuan, et al., “590 nm LED Irradiation Improved Erythema Through Inhibiting Angiogenesis of Human Microvascular Endothelial Cells and Ameliorated Pigmentation in Melasma,” Cells 11, no. 24 (2022): 3949.
19. J. Yuan, Y. Gao, L. Pi, et al., “Novel Technique for Rosacea Treatment Using Optimal Pulse Technology: In Vivo and Clinical Studies,” Journal of Cosmetic Dermatology 21, no. 12 (2022): 6767–6775.
20. J. Y. Mun, S. Y. Jeong, J. H. Kim, S. S. Han, and I. H. Kim, “A Low Fluence Q-Switched Nd:YAG Laser Modifies the 3D Structure of Melanocyte and Ultrastructure of Melanosome by Subcellular-Selective Photothermolysis,” Journal of Electron Microscopy 60, no. 1 (2011): 11–18.
21. H. Gokalp, A. D. Akkaya, and Y. Oram, “Long-Term Results in Low-Fluence 1064-Nm Q-Switched Nd:YAG Laser for Melasma: Is It Effective?,” Journal of Cosmetic Dermatology 15, no. 4 (2016): 420–426.
22. Y. Wong, S. S. Lee, and C. L. Goh, “Hypopigmentation Induced by Frequent Low-Fluence, Large-Spot-Size QS Nd:YAG Laser Treatments,” Annals of Dermatology 27, no. 6 (2015): 751–755.
23. T. Yamashita, K. Negishi, T. Hariya, et al., “Intense Pulsed Light Therapy for Superficial Pigmented Lesions Evaluated by Reflectance-Mode Confocal Microscopy and Optical Coherence Tomography,” Journal of Investigative Dermatology 126, no. 10 (2006): 2281–2286.
24. Y. H. Li, J. Z. Chen, H. C. Wei, et al., “Efficacy and Safety of Intense Pulsed Light in Treatment of Melasma in Chinese Patients,” Dermatologic Surgery 34, no. 5 (2008): 693–700; discussion 700–701.
25. S. Wenzel, M. Landthaler, and W. Baumler, “Recurring Mistakes in Tattoo Removal. A Case Series,” Dermatology 218, no. 2 (2009): 164–167.
26. M. S. Kim, Y. K. Kim, D. H. Lee, et al., “Acute Exposure of Human Skin to Ultraviolet or Infrared Radiation or Heat Stimuli Increases Mast Cell Numbers and Tryptase Expression in Human Skin In Vivo,” British Journal of Dermatology 160, no. 2 (2009): 393–402.
27. O. Kholmanskikh, N. van Baren, F. Brasseur, et al., “Interleukins 1alpha and 1beta Secreted by Some Melanoma Cell Lines Strongly Reduce Expression of MITF-M and Melanocyte Differentiation Antigens,” International Journal of Cancer 127, no. 7 (2010): 1625–1636.
28. M. Singh, S. D. Jadeja, J. Vaishnav, et al., “Investigation of the Role of Interleukin 6 in Vitiligo Pathogenesis,” Immunological Investigations 51, no. 1 (2022): 120–137.
29. R. J. Starner, L. McClelland, Z. Abdel-Malek, A. Fricke, and G. Scott, “PGE(2) is a UVR-Inducible Autocrine Factor for Human Melanocytes That Stimulates Tyrosinase Activation,” Experimental Dermatology 19, no. 7 (2010): 682–684.
30. J. I. Na, S. Y. Choi, S. H. Yang, H. R. Choi, H. Y. Kang, and K. C. Park, “Effect of Tranexamic Acid on Melasma: A Clinical Trial With Histological Evaluation,” Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 27, no. 8 (2013): 1035–1039.
31. P. Jiang, Y. Liu, J. Zhang, et al., “Mast Cell Stabilization: New Mechanism Underlying the Therapeutic Effect of Intense Pulsed Light on Rosacea,” Inflammation Research 72, no. 1 (2023): 75–88.
32. H. Y. Kang, J. S. Hwang, J. Y. Lee, et al., “The Dermal Stem Cell Factor and c-Kit Are Overexpressed in Melasma,” British Journal of Dermatology 154, no. 6 (2006): 1094–1099.
33. D. Elieh Ali Komi, S. Wohrl, and L. Bielory, “Mast Cell Biology at Molecular Level: A Comprehensive Review,” Clinical Reviews in Allergy and Immunology 58, no. 3 (2020): 342–365.
34. H. Y. Kang, P. Bahadoran, I. Suzuki, et al., “In Vivo Reflectance Confocal Microscopy Detects Pigmentary Changes in Melasma at a Cellular Level Resolution,” Experimental Dermatology 19, no. 8 (2010): e228–e233.
35. N. Masub, J. K. Nguyen, E. Austin, and J. Jagdeo, “The Vascular Component of Melasma: A Systematic Review of Laboratory, Diagnostic, and Therapeutic Evidence,” Dermatologic Surgery 46, no. 12 (2020): 1642–1650.
36. T. Passeron, “Long-Lasting Effect of Vascular Targeted Therapy of Melasma,” Journal of the American Academy of Dermatology 69, no. 3 (2013): e141–e142.
37. W. Baumler, E. Vural, M. Landthaler, F. Muzzi, and G. Shafirstein, “The Effects of Intense Pulsed Light (IPL) on Blood Vessels Investigated by Mathematical Modeling,” Lasers in Surgery and Medicine 39, no. 2 (2007): 132–139.
38. M. Kim, S. M. Kim, S. Kwon, T. J. Park, and H. Y. Kang, “Senescent Fibroblasts in Melasma Pathophysiology,” Experimental Dermatology 28, no. 6 (2019): 719–722.
39. A. C. C. Esposito, G. Brianezi, L. D. B. Miot, and H. A. Miot, “Fibroblast Morphology, Growth Rate and Gene Expression in Facial Melasma,” Anais Brasileiros de Dermatologia 97, no. 5 (2022): 575–582.
40. Y. Xiao, L. Zhou, W. Tao, et al., “Preparation of Paeoniflorin–Glycyrrhizic Acid Complex Transethosome Gel and Its Preventive and Therapeutic Effects on Melasma,” European Journal of Pharmaceutical Sciences 192 (2024): 106664.
41. A. C. C. Espósito, D. P. Cassiano, C. N. da Silva, et al., “Update on Melasma—Part I: Pathogenesis,” Dermatology and Therapy 12, no. 9 (2022): 1967–1988.
42. Z. X. Liang, M. R. Wang, X. J. Xiang, and Y. Zhao, “Treatment With Injectable Platelet-Rich Fibrin in a Rat Model of Melasma,” European Journal of Dermatology 33, no. 5 (2023): 487–494.
43. F. Song, Y. Wang, X. G. Wei, et al., “Proteomic Analysis of Two Different Methods to Induce Skin Melanin Deposition Models in Guinea Pigs,” Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology 16 (2023): 2341–2356.
44. T. B. El-Abaseri, S. Putta, and L. A. Hansen, “Ultraviolet Irradiation Induces Keratinocyte Proliferation and Epidermal Hyperplasia Through the Activation of the Epidermal Growth Factor Receptor,” Carcinogenesis 27, no. 2 (2006): 225–231.
45. N. P. Sanchez, M. A. Pathak, S. Sato, T. B. Fitzpatrick, J. L. Sanchez, and M. C. Mihm, Jr., “Melasma: A Clinical, Light Microscopic, Ultrastructural, and Immunofluorescence Study,” Journal of the American Academy of Dermatology 4, no. 6 (1981): 698–710.