У технологий красоты
есть имя — Премиум Эстетикс

Электростимуляция при частоте 448 кгц

HERNÁNDEZ-BULE ML, PAÍNO CL, TRILLO MA, ÚBEDA A. CELL PHYSIOL BIOCHEM 2014;34:1741-1755

Введение

Клетки-предшественники играют важнейшую роль в регенерации тканей. После пролиферации новые клетки сохраняют за собой первоначальную функцию тканей. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются ключевой клеточной популяцией, задействованной в пролиферативной фазе посттравматической регенерации, они присутствуют практически во всех тканях взрослых людей.

Существует установившаяся традиция успешного применения такой разновидности физиотерапии, как электрическая и электромагнитная стимуляция для содействия регенерации травматических и дегенеративных поражений ткани, а также в эстетической медицине (1-7). Среди методов электростимуляции есть емкостно-резистивная электротерапия, неинвазивный электротемпературный метод, основанный на применении электрических токов с радиочастотой 400-450 кГц.

Недавние результаты, полученные in vitro, указывают на то, что при плотности тока, обеспечивающей термальный эффект, емкостная-резистивная электротерапия имеет признаки цитотоксичности для клеток человеческого рака, причем подобный эффект усиливается инъекциями микрочастиц металла в ткани обрабатываемой опухоли (8). На клеточном уровне влияние емкостно-резистивной электротерапии не ограничивается термальным эффектом. Емкостно-резистивная электростимуляция в субтермальных (без нагрева) дозах может вызвать антипролиферативные и цитотоксические реакции в культивированных клеточных линиях рака человека, но не в первичных культурах мононуклеарных клеток человеческой крови (9-13).

Эти экспериментальные результаты можно интерпретировать как свидетельства в пользу того, что благотворный эффект применения емкостно-резистивной электротерапии в лечебных целях объясняется не только повышением температуры, но и прямыми клеточными реакциями на сам электрический стимул.

Что касается регенерации тканей, емкостно-резистивная электротерапия в настоящее время используется в физиотерапевтической реабилитации и спортивной медицине для лечения повреждений мышц, костей, связок и сухожилий (14-16). Ускорение восстановления после травм благодаря емкостно-резистивной электротерапии происходит благодаря уменьшению объема поврежденной области, а также благодаря противовоспалительным процессам, аналгезии и восстановлению мышечной функции (17-20).

Цель настоящего исследования – узнать, является ли усиление пролиферации стволовых клеток жировой ткани (разновидности МСК) одним из эффектов в рамках процессов регенерации тканей, стимулируемых емкостно-резистивной электротерапией при субтермальной плотности тока.

Материалы и методы

Клеточная культура

Стволовые клетки, полученные из жировой ткани, были изолированы из образцов подкожного жира у наших четверых здоровых доноров (двух мужчин, 65 и 69 лет, и двух женщин 29 и 35 лет). В экспериментах использовались стволовые клетки жировой ткани третьего-восьмого пассажа.

Воздействие емкостно-резистивной электростимуляции (CRET)

Воздействие токов емкостно-резистивной электротерапии на клетки (как показано на Рис. 1) состояло из 5-минутных импульсов тока частотой 448 кГц при субтермальной плотности 50 μA/мм2, разделенных 4-часовыми временными промежутками; общий период воздействия был равен 48 часам. Пары электродов были последовательно подключены к генератору сигналов (прибор INDIBA®, INDIBA SA, Барселона, Испания). Предыдущими исследованиями нашей группы (9-13) было доказано, что такие параметры воздействия влияют на пролиферацию клеток. Культуры были выращены в инкубаторах, за ними велось постоянное наблюдение. В качестве плацебо-воздействия пары электродов, установленные на контрольные лотки, были также подсоединены к генератору, но подачи энергии не было.

Рисунок 1. Воздействие тока 448 кГц, проходящего между двумя электродами in vitro. Плотность тока гомогенна на поверхности лотка, приходящейся на пространство между электродами (рабочая зона; контрольная плацебо-зона 1065 мм2). Не взятые в работу клетки были убраны с лотка и утилизированы в конце процедуры

Количественный анализ дифференциации для мезенхимальной характеризации

Чтобы оценить дифференцирующую мультипотентность полученных из жировой ткани стволовых клеток, их инкубировали в адипогенной, хондрогенной и остеогенной средах. На 15-й день инкубации в этих средах стволовых клеток из жировой ткани была проведена оценка адипогенной, хондрогенной и остеогенной дифференцировки.

Та же процедура оценки дифференцировки применялась для того, чтобы определить, возможно ли повлиять на мультипотентность стволовых клеток из жировой ткани при помощи воздействия емкостно-резистивной электротерапии.

Оценка пролиферации клеток

Воздействие емкостно-резистивной электротерапии на пролиферацию клеток определялось колориметрическим количественным анализом c применением реагента ХТТ, а также количественным выражением синтеза ДНК при помощи иммунофлуоресцентной детекции включения 5-бромдезоксиуридина (BrdU).

Анализ клеточного цикла

Потенциальный эффект воздействия на клеточный цикл был оценен при помощи проточной цитометрии с культурами в пассажах P3 и P4. Чтобы оценить клетки в фазах S и G2 клеточного цикла, был использован ядерный антиген клеточной пролиферации (PCNA), который является маркером белка, связанного с ДНК-полимеразой (21).

Результаты

Адипогенная, хондрогенная и остеогенная дифференциация стволовых клеток жировой ткани

Стволовые клетки показали четкие тенденции распределения по трем линиям: адипоциты, хондроциты и остеоциты (Рис. 2)

Рисунок 2. При помещении в адипогенную, хондрогенную и остеогенную среды клетки, изолированные из жировой ткани, дифференцируются в соответствующие клеточные линии (Диф.), в то время как при отсутствии среды (НД) клетки остаются недифференцированными. Масштабная линейка = 100 μm.

Пролиферация под действием электротерапии

Эффект электротерапии зависит от пассажа. Стволовые клетки, воздействие на которые пришлось на пассажи P3 – P5, показали статистически значимый рост числа клеток, до 25 % по сравнению с контролем в пассаже P5 (Рис. 3A). Колориметрический анализ с ХТТ подтвердил рост числа клеток до 20 % в культурах, где воздействие пришлось на пассажи P3 – P5, по сравнению с контролем (Рис. 3B).

Доля BrdU+ (бромдезоксиуридин) клеток в прошедшей электротерапию группе оказалась значительно – на 38 % – выше, чем в контрольной группе (p < 0.001).

Рисунок 3. Количественный анализ пролиферации.
(A) Флуоресцентная микроскопия позволяет подсчитать клетки, окрашенные бисбензимидом, в пассажах P2 – P8. Данные нормализированы по соответствующим контрольным выборкам.
(B) Кол. анализ с XTT на пролиферацию клеток в пассажах P3 – P7.
*: 0.01 p 0.05; **: 0.001 p 0.01: ***: p <0.001 (критерий Стьюдента).

Анализ клеточного цикла

Касательно эффекта емкостно-резистивной электротерапии на клеточный цикл, в пассажах P3 — P5 был скромный (3 %), но статистически значимый спад в доле клеток в фазе G0/G1, который сопровождался статистически значимым ростом (21 % и 10 % по сравнению с контрольной группой) клеток в фазах S и G2/M, соответственно (Рис. 4). Эти данные подкреплялись числом ядерных антигенов клеточной пролиферации PCNA в положительных клетках, где электротерапия вызвала статистически значимый рост (35 %) по сравнению с контрольной группой.

Мультипотентость стволовых клеток жировой ткани после электротерапии

Через две недели, в течение которых прошедшие воздействие электротерапии клетки и клетки контрольной группы провели в инкубаторе в присутствии соответствующей дифференцирующей среды, было обнаружено отсутствие значительных различий в схемах дифференциации в этих двух группах (Рис. 5).

Рисунок 4. Влияние электротерапии на число клеток в разных фазах цикла; процент по сравнению с контрольной группой (100 %). *: 0.01 p 0.05.

 

Рисунок 5. Мультипотентность стволовых клеток жировой ткани после электротерапии. После сеансов электротерапии (или плацебо в контрольной группе) в течение 14 дней клеточные культуры в пассажах P3 и P4 выращивались в присутствии дифференцирующих сред.
(A) верхние образцы – адипогенная среда, средние – хондрогенная и нижние – остеогенная, окрашенные масляным красным, альциановым синим и ализариновым красным соответственно. Масштаб: 100 μm.
(B) Дифференцировка стволовых клеток оценивалась при помощи окрашивания компьютерным визуальным анализом. Гистограммы показывают, что средние величины ± погрешность оптической плотности в группе электротерапии не имеет существенных отличий от соотв. параметров контрольной группы (p > 0.05).

Заключение

Полученные результаты показывают, что периодическое воздействие электрического стимула с частотой 448 кГц в рамках емкостно-резистивной электротерапии увеличивает процент клеток в фазах S, G2 и в митозе, и содействует пролиферации мезенхимальных стволовых клеток человека. Полученные результаты позволяют предположить, что емкостно-резистивная электротерапия может помогать регенерации тканей, активизируя пролиферацию стволовых клеток жировой ткани, находящихся в состоянии покоя в поврежденном участке, при этом не происходит снижения мультипотентности стволовых клеток для последующей адипогенной, хондрогенной или остеогенной дифференциации. Эти сведения в сочетании с ранее опубликованными экспериментальными данными свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что терапевтический эффект, в том числе в регенерации тканей, от сеансов емкостно-резистивной электротерапии объясняется молекулярными и клеточными механизмами, не температурными.

Таким образом, изложенные выше результаты позволяют утверждать, что емкостно-резистивная электротерапия может содействовать или ускорить заживление повреждений путем пролиферации уже делящихся стволовых клеток. Исходя из этого, можно предположить, что емкостно-резистивная электротерапия может применяться как эффективное адъювантное средство для лечения ряда повреждений тканей и сосудов или в качестве дополнительного средства у пациентов с противопоказаниями к ряду фармакологических средств. Емкостно-резистивная электротерапия может также использоваться как противовоспалительное средство.



Индивидуальная консультация

Оставьте заявку и менеджер по продажам ответит на все Ваши вопросы

Отправить
Отправляя форму, я подтверждаю, что ознакомлен с Политикой оператора
и даю Согласие на обработку персональных данных.